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3. DISKUSSION 92

effizienzen reduzieren jedoch den Wert dieser Methode deutlich. Es wurde weiterhin die

Transformation der DNA nach der Methode von Gietz et al. (Gietz, et al. 1995) untersucht.

Diese Methode wurde für die Transformation von Saccharomyces cerevisiae entwickelt und

wird dort mit hoher Transformationseffizienz (mehrere 100 Kolonien pro Transformation)

eingesetzt. Laut Angeben des Herstellers kann Pichia pastoris im Gegensatz zu

Saccharomyces cerevisiae nicht durch Verwendung von Lithiumacetat transformiert werden,

sondern es muß Lithiumchlorid verwendet werden. Es wurden verschiedene Transformations-

ansätze mit beiden Salzen gemacht, keiner erbrachte jedoch einen positiven Transformanten.

Als vierte Alternative wurde eine vereinfachte Variation der Elektroporationsmethode ver-

wendet. Die über Nacht gewachsenen Zellen wurden auf eine OD

600

von 1,0 ml

-1

verdünnt

und elektroporiert.

Insbesondere die hohe Transformationseffizienz von 100-200 Klonen pro Transformation

waren der große Vorteil dieser Methode neben der vereinfachten Handhabung der kompeten-

ten Zellen gegenüber dem Protokoll von Invitrogen.

Mit dieser Transformationsmethode konnte eine der Engstellen in der Expression von

Proteinen in Pichia pastoris - zumindest für die Expression von Wildtyp-Proteinen und

rationalen Mutanten - beseitigt werden. Bezüglich gerichteter Evolution und Zufalls-

mutagenese sind die erreichten Effizienzen jedoch immer noch zu niedrig.

3.2 Vergleich der Expression der ROL in Pichia pastoris unter

Kontrolle von zwei verschiedenen Promotoren

Die ROL konnte sowohl unter der Kontrolle des konstitutiven GAP-Promotor, als auch dem

induzierbaren AOX1 Promotors erfolgreich exprimiert werden. Die reife Lipase wurde in

beiden Fällen durch die Fusion an den α-Faktor in das Medium sekretiert. Die Expressions-

raten der einzelnen selektierten Klone eines Transformationsansatzes unterschieden sich sehr

stark. Grund hierfür kann sowohl die Anzahl der insertierten Genkopien sein (Romanos, et al.

1998), wie auch ein Phänomen, das klonale Variation genannt wird. Hierbei scheint u. a. der

Integrationsort eine Rolle zu spielen (Cregg, et al. 1993). Generell konnte jedoch beobachtet

werden, daß die Expressionsrate unter Kontrolle des GAP-Promotors mit 60 U ml

-1

um ca.

50 % geringer ausfiel, als unter Kontrolle des AOX1-Promotors mit bis zu 110 U ml

-1

. Dabei

scheint die von Beer postulierte Toxizität keine Rolle gespielt zu haben, da sich beim

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